色譜分析技術(shù):高壓液相色譜

        一、分類
??高效液相色譜可分為四種基本類型：液固色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜和尺寸排阻色譜。
?? (1) 液固色譜
??液固色譜法通常稱為吸附色譜法。吸附劑包括活性炭、氧化鋁和硅膠。液固色譜中使用的載體是硅膠。硅膠對(duì)溶質(zhì)和分子的吸附能力不是均勻分布在整個(gè)硅表面。硅膠表面有一些區(qū)域會(huì)與溶質(zhì)分子發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。這些區(qū)域是活動(dòng)場(chǎng)所。硅膠與溶質(zhì)分子之間的主要相互作用是偶極力氫。鍵和靜電相互作用。極性越強(qiáng)，化合物在硅膠柱上的停留時(shí)間越長(zhǎng)。在液固色譜中，流動(dòng)相溶劑分子和溶質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)固定彼此的活性位置，從而使溶質(zhì)從色譜柱中洗脫下來。與硅膠表面活性位點(diǎn)結(jié)合力強(qiáng)的溶劑，對(duì)溶質(zhì)分子的洗脫能力很強(qiáng)，故稱為強(qiáng)溶劑，反之亦然。液固色譜的特點(diǎn)是適用于色譜幾何異構(gòu)體的分離，可用于脂溶性化合物，如磷脂、類固醇、脂溶性維生素、前列腺素等。
?? (2) 鍵合相色譜
??鍵合相色譜是從液-液相色譜發(fā)展而來的，即分配色譜。鍵合相色譜法將固定相與載體顆粒共價(jià)結(jié)合，克服了流動(dòng)相在流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)流動(dòng)中的溶解和機(jī)械沖擊的問題。性質(zhì)逐漸變化等缺點(diǎn)。鍵合相色譜可分為正相色譜和反相色譜。
??正相色譜
??在正相色譜中，與載體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)都是極性基團(tuán)，如伯氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基。流動(dòng)相溶劑是與吸附色譜中的流動(dòng)相非常相似的非極性溶劑，如庚烷、己烷、異辛烷等。由于固定相是極性的，流動(dòng)溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)，即極性越大的溶劑是強(qiáng)溶劑。固定相與流動(dòng)相的關(guān)系與液固色譜法*相同，稱為正相色譜法。然而，正相色譜的分離原理主要是基于化合物在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，不適用于幾何異構(gòu)體的分離。
?? 2. 反相色譜
??在反相色譜中，與載體共價(jià)結(jié)合的固定相是一些直鏈烴，例如正辛基。流動(dòng)相的極性強(qiáng)于固定相的極性。反相色譜在高效液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。在反相色譜中，溶質(zhì)保留的主要功能是疏水性，在高效液相色譜中也稱為疏溶劑性。所謂疏水相互作用是指當(dāng)水中存在非極性溶質(zhì)時(shí)，溶質(zhì)分子之間的相互作用，溶質(zhì)分子與水分子之間的相互作用遠(yuǎn)小于水分子之間的相互作用，因此溶質(zhì)分子被“擠壓"從水中。出來了可見，反相色譜中疏水性越強(qiáng)的化合物越容易從流動(dòng)相中擠出，而且在色譜柱中的保留時(shí)間也長(zhǎng)，因此反相色譜中不同的化合物根據(jù)其疏水性進(jìn)行分離特性。反相色譜適用于分離具有不同疏水基團(tuán)的化合物，即具有非極性基團(tuán)的化合物。此外，反相色譜可用于分離具有不同極性基團(tuán)的化合物?？梢愿淖?nèi)軇┘捌浣M成和流動(dòng)相的 pH 值來影響溶質(zhì)分子與流動(dòng)相的相互作用并改變它們的保留行為。此外，反相色譜流動(dòng)相中水的比例非常靈活，可以/從0-100%，因此反相色譜可用于水溶性和脂溶性化合物的分離.反相色譜中的固定相是線性飽和的烷烴，它們與硅膠載體共價(jià)結(jié)合。它們的鏈長(zhǎng)不同。最長(zhǎng)的是十八烷基，它也是zui常用的固定相。線性飽和烷烴的疏水性隨著烴鏈的長(zhǎng)度增加而增加，由于疏水作用，溶質(zhì)在反相色譜柱中的保留時(shí)間也會(huì)隨著烴鏈的長(zhǎng)度增加而增加。一般來說，這意味著具有烴鏈長(zhǎng)度的反相色譜柱可以獲得更好的分辨率。在大多數(shù)情況下，它是依靠重復(fù)選擇列。由于反相色譜的固定相是疏水性烴，溶質(zhì)與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或疏水相互作用，因此溶劑的強(qiáng)度隨著極性的降低而增加。水是反相色譜中極性*的溶劑，也是最弱的溶劑。在反相色譜中，常使用堿性溶劑，并在其中加入不同濃度的可與水混溶的有機(jī)溶劑，以獲得不同強(qiáng)度的流動(dòng)相。這些有機(jī)溶劑稱為改性劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑是甲醇和乙腈。此外，乙醇、*、異丙醇和二惡烷也常用作改性劑。
??在生化分析中，反相色譜應(yīng)用極為廣泛?？捎糜冖侔被岷投嚯牡姆治?； ②蛋白質(zhì)的分離； ③堿基、核酸和核酸酶的分析； ④甾體化合物物質(zhì)分析； ⑤與其他酚胺、組胺、糖類和維生素的分離。
?? (3)離子交換層析
??離子交換色譜中的固定相是一些帶電基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。如果流動(dòng)相中還有其他帶相反電荷的離子，根據(jù)質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。當(dāng)固定相基團(tuán)帶正電時(shí)，可交換離子為陰離子，該離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電，能與流動(dòng)相交換的離子是陽離子。離子交換劑稱為陽離子交換劑。陰離子交換柱的官能團(tuán)主要是-NH2和-MH3+：陽離子交換柱的官能團(tuán)主要是-SO3H和-COOH。其中-NH3+離子交換柱和-SO3H離子交換劑是強(qiáng)離子交換劑，在較寬的pH范圍內(nèi)具有離子交換能力； -NH2和-COOH離子交換柱是弱離子交換劑，只有在一定范圍內(nèi)才有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，如氨基酸自動(dòng)分析儀中的色譜柱，多肽的分離，蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
??二、容易出問題
??(1)渦流擴(kuò)散
??當(dāng)流動(dòng)相遇到較大的固體顆粒時(shí)，會(huì)像流水打石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱子裝填不均勻，有些零件松動(dòng)或有小凹槽，流動(dòng)相的速度會(huì)很快；如果某些零件結(jié)塊或包裝緊密，則流動(dòng)會(huì)很慢。腰帶變寬了。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，柱子的填料要緊密均勻，這樣渦流擴(kuò)散小，柱效高。
?? (2) 分子擴(kuò)散
??分子擴(kuò)散是物質(zhì)分子從高濃度區(qū)向低濃度區(qū)的運(yùn)動(dòng)，也稱為縱向分子擴(kuò)散。為了減少分子擴(kuò)散，使用小而均勻的固體顆粒填充色譜柱。同時(shí)，在操作過程中，如果流速過慢，被分離的物料停留時(shí)間長(zhǎng)，擴(kuò)散會(huì)很嚴(yán)重。
?? (3) 傳質(zhì)
??被分離的物質(zhì)必須在流動(dòng)相和固定相中平衡，這樣才能形成一個(gè)狹窄的區(qū)域。在液相色譜中，溶質(zhì)分子在兩個(gè)液相之間分離。制備或吸附和解吸在固相上需要一定的時(shí)間。流速快時(shí)，傳遞速度慢，在達(dá)到平衡動(dòng)態(tài)相前向前移動(dòng)。這些物質(zhì)的非平衡運(yùn)動(dòng)使區(qū)域變寬。
?? (4) 移動(dòng)相流量
??當(dāng)流速過低時(shí)，分子擴(kuò)散嚴(yán)重，尤其是在氣相色譜中。例如，如果將理論塔板高度與流速作圖，則理論塔板高度隨著流速的增加而迅速降低。當(dāng)達(dá)到最小值時(shí)，隨著流速的增加，傳質(zhì)將起主要作用，理論塔板高度再次增加。在高效液相色譜中，較快的流速影響不大，但在凝膠過濾色譜中，由于物質(zhì)必須滲透到凝膠內(nèi)部，傳質(zhì)影響很大，流速會(huì)降低柱效.
?? (5) 固定相顆粒大小
??固定相顆粒越小，柱效越高，流動(dòng)相流動(dòng)阻力越大。必須增加壓力才能使其流動(dòng)。